
手把手教您掌握钙黄绿素-钴淬灭法检测线粒体通透性转换孔杠杆炒股网
在细胞受到某些强效压力(如钙离子超载、剧烈氧化应激)时,线粒体内膜上的一个关键通道——线粒体通透性转换孔(MPTP)——会发生持续性开放。这相当于细胞能量工厂的“安全阀门”被卡在了打开状态,直接导致膜电位崩溃、能量生产中断和细胞功能发生不可逆转变。因此,检测MPTP的开放状态,是从机制上游评估线粒体膜完整性与功能的关键手段。
目前,基于钙黄绿素(Calcein AM)与氯化钴(CoCl₂)淬灭联合的流式细胞术方法被广泛采用。其原理精妙,可分为三步理解:
全细胞标记: 脂溶性的Calcein AM自由进入活细胞,被胞内酯酶水解为水溶性的、发强绿色荧光的Calcein分子,滞留在整个细胞内(包括胞浆和线粒体)。 胞浆荧光特异性淬灭: 加入Co²⁺(来自CoCl₂),它能进入胞浆并与Calcein结合,高效淬灭其荧光。由于正常关闭的MPTP和线粒体内膜屏障,Co²⁺无法进入线粒体基质,因此此时仅有线粒体内的Calcein保持绿色荧光。 诱导MPTP开放与观察: 随后加入MPTP诱导剂(如钙离子载体Ionomycin,诱导钙超载)。若MPTP被成功诱导开放,Co²⁺得以进入线粒体,淬灭其中的Calcein荧光,导致绿色荧光信号显著下降。荧光减弱程度直接反映了MPTP开放的程度。展开剩余44%实验操作关键要点与注意事项:
标准化与避光: 细胞培养、染色孵育时间与温度需严格保持一致,整个染色及检测过程需避光操作。 浓度优化: Calcein AM和CoCl₂的最佳工作浓度需根据不同细胞类型进行预实验优化,以达到清晰的特异性标记与淬灭效果。 对照设置至关重要: 必须设立明确的阴性对照(仅Calcein AM染色,整体强荧光)和阳性对照(Calcein AM + CoCl₂ + Ionomycin,线粒体荧光被淬灭),以验证实验体系的有效性。 流式设置: 使用FITC通道(或相应绿色荧光通道)检测Calcein荧光,并确保仪器校准。此方法侧重于评估线粒体膜通道的“通透性”功能状态,与JC-1等直接检测“电位”的方法形成有力互补杠杆炒股网,尤其适用于心肌缺血再灌注损伤、特定神经毒性、药物肝毒性等研究领域。亚科因生物(Abbkine) 推出的线粒体通透性转换孔(MPTP)检测试剂盒(货号KTA4002),将这一经典方法转化为经过系统优化的即用型试剂方案,并配有详细的操作视频与指南,助您精准捕获这一关键生物学事件。
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